Control de calidad del ARN
Cada lote de ARN se cuantifica, se evalúa su integridad y se controla su pureza antes de cualquier envío o construcción de banco.
La calidad del ARN condiciona el éxito del banco VHH.
Un ARN degradado o contaminado compromete directamente la eficacia de la transcripción inversa y de la amplificación del repertorio VHH por RT-PCR. Por eso cada extracto se cualifica sistemáticamente antes de su validación, ya sea destinado a un proyecto de banco inmune o enviado como producto de ARN naïve.
Tres controles complementarios, en cada lote.
Cuantificación fluorométrica
La concentración se mide por fluorometría (Qubit), un método que utiliza un colorante que se une específicamente al ARN. A diferencia de la espectrofotometría (tipo Nanodrop), no se ve alterada por contaminantes que absorben a 260 nm y ofrece una estimación más fiable de la concentración real de ARN.
Evaluación de la integridad
La integridad se evalúa mediante electroforesis capilar en un sistema Agilent TapeStation, que genera un electroferograma del perfil ribosómico (picos 18S y 28S) y calcula una puntuación RINe (RNA Integrity Number equivalent) de 1 (ARN totalmente degradado) a 10 (ARN perfectamente intacto).
Control de pureza
Se verifican las relaciones de absorbancia A260/280 y A260/230 para detectar posibles contaminaciones proteicas, fenólicas o por sales caotrópicas residuales de las etapas de extracción. Una preparación pura presenta relaciones entre 1,8 y 2,1.
Electroferograma de una muestra de ARN total de alta integridad.
Dos picos nítidos correspondientes a los ARN ribosómicos 18S y 28S, una línea base plana y poco ruido en tamaños bajos: la firma de un ARN mínimamente degradado.
Umbrales aplicados antes de validar un lote.
| Parámetro | Método | Umbral de validación |
|---|---|---|
| Concentración | Medición fluorométrica (Qubit) | Según volumen y uso previsto |
| Integridad (RINe) | TapeStation | ≥ 7,0 para construcción de banco |
| Pureza A260/280 | Espectrofotometría | 1,8 – 2,1 |
| Pureza A260/230 | Espectrofotometría | 1,8 – 2,1 |
| Control visual del perfil | Electroferograma | Picos 18S / 28S distintos, línea base plana |
Un RIN más alto, un banco VHH más representativo.
Una puntuación RINe superior a 7 suele ser necesaria para una amplificación fiable del repertorio VHH por RT-PCR: un ARN degradado produce amplicones más cortos, menos representativos de la diversidad real del repertorio inmunitario, y reduce el número de clones funcionales recuperables durante el cribado por phage display.