RNA-Qualitätskontrolle
Jede RNA-Charge wird quantifiziert, ihre Integrität bewertet und ihre Reinheit kontrolliert, vor jedem Versand oder Bibliotheksaufbau.
Die RNA-Qualität bestimmt den Erfolg der VHH-Bibliothek.
Abgebaute oder kontaminierte RNA beeinträchtigt direkt die Effizienz der reversen Transkription und der RT-PCR-Amplifikation des VHH-Repertoires. Deshalb wird jeder Extrakt vor der Freigabe systematisch qualifiziert, unabhängig davon, ob er für ein Immunbibliotheksprojekt bestimmt oder als naives RNA-Produkt versendet wird.
Drei ergänzende Kontrollen, für jede Charge.
Fluorometrische Quantifizierung
Die Konzentration wird durch Fluorometrie (Qubit) gemessen, eine Methode, die einen spezifisch an RNA bindenden Farbstoff verwendet. Im Gegensatz zur Spektrophotometrie (z. B. Nanodrop) wird sie nicht durch bei 260 nm absorbierende Kontaminanten verfälscht und liefert eine zuverlässigere Schätzung der tatsächlichen RNA-Konzentration.
Integritätsbewertung
Die Integrität wird durch Kapillarelektrophorese auf einem Agilent-TapeStation-System bewertet, das ein Elektropherogramm des ribosomalen Profils (18S- und 28S-Peaks) erzeugt und einen RINe-Score (RNA Integrity Number equivalent) von 1 (vollständig abgebaute RNA) bis 10 (vollständig intakte RNA) berechnet.
Reinheitskontrolle
Die Absorptionsverhältnisse A260/280 und A260/230 werden geprüft, um mögliche Protein-, Phenol- oder Restsalzkontaminationen aus den Extraktionsschritten zu erkennen. Eine reine Präparation weist Verhältnisse zwischen 1,8 und 2,1 auf.
Elektropherogramm einer Gesamt-RNA-Probe mit hoher Integrität.
Zwei scharfe Peaks, die den ribosomalen RNAs 18S und 28S entsprechen, eine flache Grundlinie und wenig Rauschen im niedermolekularen Bereich: die Signatur einer minimal abgebauten RNA.
Vor der Freigabe einer Charge angewandte Schwellenwerte.
| Parameter | Methode | Freigabeschwelle |
|---|---|---|
| Konzentration | Fluorometrische Messung (Qubit) | Abhängig von Volumen und Verwendungszweck |
| Integrität (RINe) | TapeStation | ≥ 7,0 für Bibliotheksaufbau |
| Reinheit A260/280 | Spektrophotometrie | 1,8 – 2,1 |
| Reinheit A260/230 | Spektrophotometrie | 1,8 – 2,1 |
| Visuelle Profilkontrolle | Elektropherogramm | Deutliche 18S-/28S-Peaks, flache Grundlinie |
Ein höherer RIN bedeutet eine repräsentativere VHH-Bibliothek.
Ein RINe-Score über 7 ist im Allgemeinen für eine zuverlässige RT-PCR-Amplifikation des VHH-Repertoires erforderlich: abgebaute RNA erzeugt kürzere Amplikons, die weniger repräsentativ für die tatsächliche Diversität des Immunrepertoires sind, und verringert die Anzahl der beim Phage-Display-Screening wiedergewinnbaren funktionalen Klone.