RNA-Extraktion nach Gewebe
Jedes Gewebe bietet ein anderes Fenster zum Immunrepertoire des Lamas. Wir passen die Entnahmequelle an Ihr Projekt an.
Von der Immunzelle zur RNA, die das VHH-Repertoire kodiert.
Die für VHH-Domänen kodierende RNA wird von den B-Lymphozyten und Plasmazellen des immunisierten Lamas getragen. Diese Zellen verteilen sich auf mehrere Kompartimente — zirkulierendes Blut, sekundäre lymphatische Organe, Knochenmark —, deren Zugänglichkeit und Zusammensetzung der Zelluntergruppen sich unterscheiden.
Die Gewebewahl hängt vom Immunisierungsstadium, der gewünschten Repertoire-Diversität und der Invasivität der Entnahme ab. Für die überwiegende Mehrheit der Projekte genügt peripheres Blut; tiefere lymphatische Gewebe sind spezifischen Anforderungen an Diversität oder Plasmazellreifung vorbehalten.
Vier Immunkompartimente, vier Repertoire-Profile.
Peripheres Blut
PBL / PBMC — StandardwegPeriphere Blutlymphozyten (PBL) oder mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) werden nach jeder Blutentnahme durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert. Dies ist die am wenigsten invasive Quelle: Sie kann zu mehreren Zeitpunkten des Immunisierungsplans wiederholt werden, um die Entwicklung des Repertoires über aufeinanderfolgende Auffrischungen zu verfolgen, ohne chirurgischen Eingriff.
Lymphknoten
Hohe B-Zell-DiversitätLymphknoten sind der Ort, an dem aktivierte B-Lymphozyten reifen. Nach den letzten Auffrischungsimmunisierungen sind sie besonders reich an Plasmazellen, die hochaffine Antikörper produzieren, wodurch Bibliotheken mit bereits durch somatische Hypermutation gereiften Klonen angereichert werden können.
Milz
Lymphatisches ReservoirAls bedeutendes sekundäres lymphatisches Organ wird die Milz herangezogen, wenn ein tieferer Gewebezugang erforderlich ist, um die Repräsentation des Immunrepertoires zu maximieren, ergänzend oder alternativ zu peripherem Blut.
Knochenmark
Reife PlasmazellenDas Knochenmark beherbergt langlebige Plasmazellen. Es ist eine ergänzende Quelle für Projekte, die ein Repertoire reifer, zeitlich stabiler Antikörper benötigen, die eine etablierte Immungedächtnis repräsentieren.
Welches Gewebe für welches Ziel?
| Gewebe | Invasivität | Diversität / Profil | Anwendungsfall |
|---|---|---|---|
| Peripheres Blut (PBL/PBMC) | Minimal — Blutentnahme | Standard, im Zeitverlauf wiederholbar | Routinemäßiger Aufbau von Immunbibliotheken |
| Lymphknoten | Moderat | Hoher Anteil reifer Plasmazellen | Anreicherung hochaffiner Klone |
| Milz | Invasiv | Sehr hoch, breite Repräsentation | Projekte mit maximalem Diversitätsbedarf |
| Knochenmark | Moderat bis invasiv | Langlebige Plasmazellen | Reifes, zeitstabiles Antikörper-Repertoire |
Extraktion unmittelbar nach der Entnahme durchgeführt.
Zellisolierung
PBL/PBMC werden direkt nach der Blutentnahme durch Dichtegradientenzentrifugation (z. B. Ficoll) isoliert.
Gesamt-RNA-Extraktion
Die Gesamt-RNA wird nach einer Referenzmethode (Guanidiniumthiocyanat-Phenol-Chloroform) extrahiert, ohne Verzögerung, um Abbau zu begrenzen.
Reverse Transkription
Die Boten-RNA wird durch Oligo(dT)-Priming in cDNA umgeschrieben, dem Ausgangspunkt für die nachfolgende Amplifikation des VHH-Repertoires.
Qualitätskontrolle
Jeder Extrakt wird vor der Freigabe quantifiziert und seine Integrität bewertet — siehe unsere Seite zur Qualitätskontrolle.